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细菌的荚膜染色
 

  (一)实验目的:学习细菌的荚膜染色法:
 
  (二)实验原理:由于荚膜与染料间的亲和力弱,不易着色,通常采用负染色法染荚膜,即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色,从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上,故染色时一般不加热固定,以免荚膜皱缩变形。
 
  (三)实验器材
 
  1. 活材料:培养3-5天的胶质芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus,俗称“钾细菌”)。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时,荚膜丰厚。
 
  2. 染色液和试剂 :Tyler法染色液:(见附二、(一)、14)、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液(见附二、(一)、2)、黑素(见附二、(一)、7)、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。
 
  3. 器材: 载玻片、玻片搁架, 擦镜纸、显微镜等。
 
  (四)实验方法
 
  推荐以下四种染色法,其中以湿墨水方法较简便,并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。
 
  1. 负染色法:
 
  (1)制片:取洁净的载玻片一块,加蒸馏水一滴,取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。
 
  (2)干燥:将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。
 
  (3)染色:在涂面上加复红染色液染色2-3min.
 
  (4)水洗:用水洗去复红染液。
 
  (5)干燥:将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。
 
  (6)涂黑素:在染色涂面左边加一小滴黑素,用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素,使黑素沿玻片边缘散开,然后向右一拖,使黑素在染色涂面上成为一薄层,并迅速风干。
 
  (7)镜检:先低倍镜,再高倍镜观察。
 
  结果:背影灰色,菌体红色,荚膜无色透明。
 
  2. 湿墨水法
 
  (1)制菌液:加1滴墨水于洁净的载玻片上,挑少量菌体与其充分混合均匀。
 
  (2)加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上,然后在盖玻片上放一张滤纸,向下轻压,吸去多余的菌液。
 
  (3)镜检:先用低倍镜、再用高倍镜观察。
 
  结果:背景灰色,菌体较暗,在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。
 
  3. 干墨水法
 
  (1)制菌液:加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端,挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合,再加1环墨水,充分混匀。
 
  (2)制片:左手执玻片,右手另拿一边缘光滑的载玻片,将载玻片的一边与菌液接触,使菌液沿玻片接触处散开,然后以30度角,迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端,使菌液铺成一薄膜。
 
  (3)干燥:空气中自然干燥。
 
  (4)固定:用甲醇浸没涂片,固定1 min,立即倾去甲醇。
 
  (5)干燥:在酒精灯上方,用文火干燥。
 
  (6)染色:用甲基紫染1-2min.
 
  (7)水洗:用自来水轻洗,自然干燥。
 
  (8)镜检:先用低倍镜再高倍镜观察。
 
  结果:背景灰色,菌体紫色,荚膜呈一清晰透明圈。
 
  4. Tyler法
 
  (1)涂片:按常规法涂片,可多挑些菌体与水充分混合,并将粘稠的菌液尽量涂开,但涂布的面积不宜过大。
 
  (2)干燥:在空气中自然干燥。
 
  (3)染色:用Tyler染色液染5-7min.
 
  (4)脱色:用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫,脱色要适度(冲洗2遍)。用吸水纸吸干,并立即加1-2滴香柏油于涂片处,以防止CuSO4结晶的形成。
 
  (5)镜检:先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。
 
  结果:背景蓝紫色,菌体紫色,荚膜无色或浅紫色。
 
  (五)注意事项
 
  1. 加盖玻片时不可有气泡,否则会影响观察。
 
  2. 应用干墨水法时,涂片要放在火焰较高处并用文火干燥,不可使玻片发热。
 
  3. 在采用Tyler法染色时,标本经染色后不可用水洗,必须用20%CuSO4冲洗。

 

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